За допомогою природного відбору вдалося отримати новий білок, що виправляє одні генетичні літери в ДНК на інші.
Серед методів редагування геному зараз найпопулярніший - метод CRISPR/Cas, про який ми неодноразово розповідали. Коротко суть його така: у клітку запускається особливий білок (Cas), який ріже ДНК там, де необхідно внести якісь зміни - наприклад, усунути мутацію. Білок шукає правильну адресу за допомогою молекули РНК, яку синтезують спеціально для експерименту і яку він тримає при собі. Молекула РНК знаходить у клітинній ДНК потрібну послідовність, після чого білок, як ми щойно сказали, ріже тут обидві нитки ДНК. Розрив приваблює клітинні ремонтні машини, які намагаються виправити пошкодження. Виправляючи, він замінюють пошкоджений шматок ДНК на новий, але для цього потрібен якийсь шаблон, за яким можна зробити «заплатку». Таким шаблоном може бути парна хромосома, на якій немає мутації, або знову ж спеціально синтезована невелика ДНК, яку ми запускаємо в клітку разом з усією CRISPR-машинерією.
Метод зручний тим, що редагуючий апарат можна легко направити на будь-яку послідовність - зробити потрібну молекулу РНК з адресою дуже легко. Однак є ймовірність, що в ДНК з'являться непередбачені зміни, і з'являться саме через розрізання/ремонту. Тому біотехнологи модифікували ріжучий білок в CRISPR/Cas так, щоб він не різав обидві нитки ДНК, а просто сідав на потрібне місце. А разом з ним сюди приходить інший білок, який прямо в ДНК перетворює одну генетичну букву в іншу.
Як ми знаємо, ДНК (і РНК) являють собою довгі послідовності чотирьох азотистих підстав - складних молекул, які цілком можна називати генетичними літерами (підстави прикріплені з цукро-фосфатної основі, але нам зараз це не важливо). Нуклеотиди позначаються літерами А (аденін), Т (тимін), Г (гуанін) і Ц (цитозин), і в двох ланцюгах ДНК навпроти Г завжди буде стояти Ц, а навпроти А - Т. Якщо ми поміняємо Ц на Т, то в молекулі ДНК виникне напруженість, оскільки навпроти новоявленого Т буде стояти не його законна пара анадін - залишений ана анадін - анадін. І в такому випадку клітина намагається виправити послідовність, відновити правильне спарювання.
Білок, який перетворює одну букву в іншу і який ми вносимо в клітку разом з системою CRISPR/Cas, називається цитидин дезаміназа. Детально про неї говорити ми не будемо, скажемо лише, що з її допомогою можна точково змінити букву С на букву Т. Тут, повторимо, не потрібно рвати обидва ланцюги ДНК, а потім за шаблоном робити велику «заплатку» на пошкоджене місце. Просто пара цитозин-гуанін змінюється на пару тимін-аденін, тому сторонніх помилок в околицях адреси тут не трапляється. Але виправлення С на Т - лише одне з теоретично можливих. Однак так вийшло, що зробити іншу зміну, перетворити букву А на букву Г, досі було не можна, відповідного ферменту не існувало в природі.
Ніколь Гауделлі (Nicole M. Gaudelli) і її колегам з Гарварда вдалося отримати такий фермент, і чудово те, що отримували вони його за допомогою еволюції. У кишкової палички є білок, який перетворює аденін на інозин - це ще одна азотиста підстава, яка дуже схожа на гуанін. Однак бактеріальний фермент працює тільки з РНК, і змусити його працювати з ДНК поки нікому не вдавалося.
Тоді дослідники пішли на хитрість. Вони забезпечили бактерій мутантним геном стійкості до антибіотика хлорамфениколу: щоб ген стійкості почав працювати, в ньому було замінити А на інозин. Кишкову паличку змушували рости в живильному середовищі з антибіотиком і чекали, коли в той білок, який змінює аденін на інозин в РНК, потрапить мутація, яка дозволила б йому зробити те ж саме в ДНК - з таким мутантним білком бактерії могли б вижити в присутності антибіотика.
У підсумку під тиском відбору потрібний білок у бактерій з'явився, і його навіть вдалося тим же шляхом удосконалити - так, щоб він міняв нуклеотиди в будь-якому контексті (тобто незалежно від того, які у нього поруч сусіди), і щоб він був досить ефективний. Можна сказати, що еволюція бактерій набагато швидше зробила для біологів більшу частину роботи.
Новий фермент працює не тільки в бактеріальних, але і в людських клітинах, причому ніяких сторонніх виправлень в редагованому фрагменті ДНК не з'являється. Те, що він перетворює аденін не в сам гуанін, а в близький нуклеотид інозин, насправді не страшно - інші клітинні машини, виявивши інозин в ДНК, зроблять в цьому місці гуанін. У статті в Nature йдеться, що отриманий в результаті лабораторної еволюції білок зумів виправити в клітинній культурі справжню шкідливу мутацію, через яку виникає спадковий гемохроматоз - хвороба, пов'язана з порушеннями в засвоєнні заліза організмом. Ефективність заміни становить поки що 30%, але в перспективі автори роботи сподіваються її підвищити. Очевидно, за допомогою «еволюційного» методу можна отримати редагуючі ферменти і для зворотних замін (щоб перетворювати гуанін на цитозин, а аденін на тимін), і тоді ми станемо ще на кілька кроків ближче до створення точної та універсальної генної терапії.
За матеріалами The Scientist.