Наукові відкриття, удостоєні цього року премії з хімії, стали можливі завдяки еволюційному підходу до хімії біомолекул.
Нинішню Нобелівську премію з хімії хочеться назвати однією з найбільш біологічних - тому що над усіма трьома лауреатами в буквальному сенсі віє дух Дарвіна. Френсіс Арнольд (Frances H. Arnold) з Каліфорнійського технологічного інституту отримала половину премії за метод спрямованої еволюції ферментів; Джордж Сміт (George P. Smith) з Міссурійського університету і Грегорі Вінтер (Gregory P. Winter) з Кембриджу разом розділили іншу половину премії за метод фагового дисплея у відборі пептидів і антитіл - в обох випадках мова йде про використання в хімії еволюційних механізмів. Ми звикли думати, що еволюція стосується тільки слонів, мишей, бактерій, пшениці тощо, проте одні з головних принципів еволюційного розвитку, мінливість і відбір, цілком працюють і на рівні біомолекул.
Як ми знаємо, ферменти - це великі (іноді дуже великі) білкові молекули, що виконують ті чи інші хімічні реакції, що виконують дуже швидко і дуже ефективно. Думка використовувати ферменти для того, щоб вони створювали нам нові матеріали і речовини, з'явилася в науковому світі досить давно. Однак білки працюють тільки в умовах живого організму, тобто у водному розчині певної температури, визначеної концентрацією солей, рівнем рН тощо. Крім того, всі ферменти виконують тільки свої реакції: вони розщеплюють, з'єднують, перетворюють лише ті молекули, на яких вони спеціалізуються. Припустимо, ми хочемо, щоб якийсь фермент став розщеплювати якусь речовину, з якою він раніше справи не мав; більш того, бажано, щоб реакція йшла не у воді, а, наприклад, в органічному розчиннику. Що для цього потрібно зробити?
Для цього потрібно змінити структуру ферменту. Як і всякий білок, він являє собою складно скручений ланцюг з амінокислот. Послідовність амінокислот визначає, чим і як займається білкова молекула. Здавалося б, чого простіше: властивості амінокислот давно відомі, їх взаємини в поліпептидному ланцюгу теж можна прорахувати, значить, вся справа лише в тому, щоб у ферменті переставити або замінити деякі амінокислоти іншими. Однак це легше сказати, ніж зробити. Ферменти складаються з сотень і тисяч амінокислот, і навіть зараз, із застосуванням потужних обчислювальних алгоритмів, не завжди можна точно сказати, як та чи інша амінокислотна заміна вплине на просторову структуру і функції білка.
Тому Френсіс Арнольд, яка спочатку вивчилася на аерокосмічного інженера-механіка і згодом переключилася на початку 80-х років на ферменти, вирішила в прямому сенсі покластися на природу. Арнольд експериментувала з ферментом субтилізином, який розщеплює молочний білок казеїн - ідея була змусити субтилізин працювати не у воді, а в органічному розчиннику диметилформаміді. У той час білки вже можна було вирощувати в бактеріях, потрібно було тільки методами генетичної інженерії забезпечити бактерію геном необхідного білка. Арнольд і її колеги вносили в ген субтилізину випадкові мутації і вводили мутантні гени в бактерію. Потім білки перевіряли в 35-відсотковому розчині диметилформаміду. З мутантних білків хтось працював у диметилформаміді краще, хтось гірше, і для наступного етапу відбирали тих, хто працював краще - в них вносили нову порцію мутацій, і все повторювалося.
По суті, все відбувалося так само, як і при звичайній еволюції: у групі мишей з'являються випадкові мутації, які в деяких випадках допомагають мишам виживати за тих чи інших умов, і коли ці самі умови настають, перевагу в популяції отримують конкретні особини. Тільки у випадку з ферментом умови задавав експериментатор, він же вносив зміни в білок і він же оббирав найбільш вдалі варіанти.
Через три «покоління» субтилізинів дослідники отримали варіант ферменту, який працював у диметилформаміді в 256 разів ефективніше, ніж вихідний білок. У цьому надефективному субтилізині виявилося десять мутацій, які повинні були опинитися в ньому саме всі разом - поодинці у мутацій нічого б не вийшло.
Такий був перший крок; другий зробив голландський дослідник Віллем Штеммер (Willem P. C. Stemmer), який теж міг би отримати свою частину премії, якби не помер у 2013 році. Він ввів у штучну еволюцію ферментів ще один природний процес - перетасовування фрагментів ДНК між генами. У нас така перетасовка відбувається при формуванні статевих клітин: різні варіанти одного і того ж гена, обмінюючись власними фрагментами, отримують один від одного ті чи інші мутації, таким чином підвищується мінливість білків, і серед них з'являються такі, які об'єднують в собі разу кілька мутаційних «плюсів». Штеммер організував те ж саме при відборі ферментів: у пробірці плавало безліч шматків ДНК, що відносяться до одного і того ж білка, і ці шматки за допомогою спеціальних ферментів постійно з'єднувалися один з одним. Потім хімічні гени відправляли в бактерії і потім порівнювали варіанти готових білків.
У міру розвитку методів генетичної інженерії вдосконалювалася і лабораторна еволюція ферментів. Френсіс Арнольд продовжувала працювати в цій області, і зараз на рахунку її лабораторії вже маса білків, що виконують різні хімічні реакції, які не зустрічаються в природі, але без яких не може обійтися, наприклад, фармацевтична промисловість та інші (біо) хімічні галузі.
Історія другої половини премії - за фаговий дисплей - теж бере початок у першій половині 80-х років. У той час про білки знали більше, ніж про гени; на руках у дослідників було багато відомих білкових молекул, але ніхто не знав, в якому місці геному вони закодовані. Джордж Сміт запропонував використовувати для пошуку генів бактеріальних вірусів, або бактеріофагів (або просто фагів). Фаги, як і будь-які інші віруси, проникають в клітку і змушують її копіювати власний фаговий геном і синтезувати фагові білки. Ідея Сміта полягала в тому, щоб у ДНК вірусу вставити невідому ДНК (на той момент на руках у дослідників були цілі бібліотеки ДНК з різних геномів, тільки ніхто не знав, що в них закодовано).
У результаті у фаговій ДНК наш білок закодують поруч із фаговим білком - найкраще поруч із тим, який утворює білкову оболонку вірусу (капсид). І коли вірусна частинка збереться, в оболонці вірусу буде стирчати і наш білок. Так можна отримати цілий набір вірусних частинок з найрізноманітнішими чужорідними білками. Притому ми пам'ятаємо, що ми шукаємо ДНК до відомого білка. На фагових частинках сидітиме безліч різних білків, синтезованих на різних фрагментах з нерозшифрованої бібліотеки. Як ми можемо зловити вірусні частинки, в які потрапила ДНК саме з нашим відомим білком? За допомогою антитіл. За антитіла до білка ми витягнемо з фагового супу ті частинки, в яких є наш білок і його ДНК, потім прочитаємо геном фага з тією вставкою, яку ми самі в нього вставили - і так дізнаємося потрібний ген.
Так з'явився метод фагового дисплея. Про нього скоро стало ясно, що у нього є і маса інших додатків, крім як пошук відповідності між білками і генами. Грегорі Вінтер, наш третій лауреат, пристосував цей метод для відбору антитіл. Імунітет, як відомо, виробляє величезну кількість антитіл-імуноглобулінів - величезну як у сенсі кількості, так і в сенсі різноманітності. У його асортименті завжди знайдеться антитіло, яке зможе зв'язатися з якоюсь досі невідомою бактеріальною або вірусною молекулою і повідомити організму про небезпеку. Медики і біотехнологи давно хотіли використовувати імуноглобуліни через їхні чудові здібності дуже специфічно і дуже міцно пов'язувати тільки конкретні молекули і не звертати уваги ні на які інші. Спочатку антитіла для дослідницьких потреб отримували, вводячи лабораторним мишам певні молекули (наприклад, білки ракових клітин), і організм тварин напрацьовував потрібні імуноглобуліни. Але таким способом можна було далеко не завжди отримати антитіла в необхідних кількостях; крім того, мишачі білки, якщо їх вводили людям, обурювали людський імунітет.
Вінтер ввів у геном фага шматок ДНК, що кодує людський імуноглобулін - причому той шматок, який кодує «хапальну» частину білка (тобто ту, яка безпосередньо розпізнає іншу молекулу). Це була ідея з фагового дисплея - ввести у вірус потрібний білок. Тільки тепер на поверхні вірусу сидів фрагмент антитіла. Такий вірус можна було виловити з безлічі інших якраз за допомогою тієї молекули, з якою повинно було зв'язуватися антитіло. Але серед імуноглобулінів є більш ефективні і менш ефективні - ті, які взаємодіють зі «своєю» молекулою більш міцно і більш специфічно, і ті, які взаємодіють з нею гірше. І тут у справу знову вступають еволюційні методи: Вінтер і його колеги вбудовували у фагову ДНК безліч різних варіантів ДНК антитіл. Всі варіанти були проти однієї і тієї ж молекули, але у всіх неминуче була різна ефективність. Потім починався відбір: фагів виловлювали, аналізували, які варіанти ДНК кодують найбільш ефективні антитіла, і потім в ці варіанти вносили нові мутації. Процедура повторювалася, і на наступному етапі відбирали тих мутантів, які виявилися ще більш ефективними. Причому все це було людські білки - адже у фаг вставляли фрагмент людського гена.
Відбір антитіл за допомогою фагового дисплея швидко знайшов застосування у фармацевтичній промисловості. Сам Вінтер з колегами зробив у 90-ті роки людські антитіла, які успішно придушували аутоімунні процеси; препарат на основі цих антитіл почали використовувати для лікування псоріазу і ревматоїдного артриту. І, природно, потім справа дійшла до імуноглобулінів, які дуже специфічно взаємодіють з білками ракових клітин. (Точніше, мова йде про полегшені версії імуноглобулінів - такі «фагово-дисплейні» білки являють собою тільки робочу, що розпізнає частину антитіла.)
Перелічувати всілякі програми білків, що відбираються за допомогою фагового дисплея, можна довго - як і у випадку з ферментами, які отримують шляхом відбору в пробірці. І практичне, і теоретичне значення нобелівських відкриттів не викликає сумнівів. Однак нам здається важливим ще раз підкреслити, що обидва відкриття сталися як результат глибокого розуміння еволюційної теорії - яка, як ми бачимо допомагає не просто відверто осмислювати світ навколо, але і приносить безпосередні практичні плоди.
За матеріалами Нобелівського комітету.